为卡斯蒂利亚和莱昂的女王。
伊莎贝拉的统治开局并不顺利。
亨利四世曾指定伊莎贝拉为继承人，所以当她在1474年登上王位时，已有数个针对她的阴谋。
迭戈·帕切科，比利亚纳侯爵，以及他的追随者们主张亨利的女儿乔安娜·贝尔特拉内哈（Joanna la beltraneja）才是合法的女王。
不久之后，侯爵提出了他的主张，托莱多大主教——他的曾祖父且曾长期支持伊莎贝拉——离开了朝廷并与他合谋。
他们计划让乔安娜与她的叔叔，葡萄牙国王阿方索五世结婚，并入侵卡斯蒂利亚以夺取王位。
1475年5月，阿方索国王带领他的军队进入西班牙并推进到普拉森西亚。
在那里，他娶了年轻的乔安娜。
接着，一场关于卡斯蒂利亚继承权的漫长而血腥的战争爆发。
这场战争来回持续了将近一年，直到1476年3月1日的托罗战役（battle of toro），在这场战役中，双方都宣称自己获胜并进行庆祝。
阿方索五世的军队被由阿尔瓦公爵和门多萨红衣主教指挥的卡斯蒂利亚中左翼击败，而葡萄牙的约翰（John of pal）所率领的部队则击败了卡斯蒂利亚右翼并控制了战场。
尽管战果不明，但托罗战役在政治上为天主教双王带来了巨大的胜利，确保了他们的王位，因为乔安娜·贝尔特拉内哈的支持者解散了，而没有盟友的葡萄牙军队也撤离了卡斯蒂利亚。
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正如历史学家胡斯托·L·冈萨雷斯（Justo L. González）所总结的：
“双方在托罗营地对峙，结果是一场未决的战斗。但当葡萄牙国王重新集结部队时，费迪南德却将消息发送到卡斯蒂利亚的各个城市以及几个外国王国，宣称取得了一场巨大的胜利，葡萄牙人被彻底击溃。面对这些消息，‘贝尔特拉内哈党’（乔安娜的支持者）解散了，葡萄牙人被迫回到了他们的王国。”
伊莎贝拉展现了极大的政治远见，利用这个时机在马德里—塞哥维亚（madrigal-Segovia）召集了宫廷会议（1476年4月至10月），在会议上，她的大女儿伊莎贝拉（Isabella）首次被宣誓为卡斯蒂利亚王位的继承人。
这相当于确认了伊莎贝拉自己的王位合法性。
同年8月，伊莎贝拉展示了她作为一名强有力统治者的能力。
塞哥维亚发生了叛乱，而她的丈夫费迪南德当时正在外作战。
伊莎贝拉不顾男性顾问们的建议，独自骑马进入城中与叛军谈判。
她的谈判非常成功，叛乱很快得以平息。
两年后，伊莎贝拉通过1478年6月30日她的儿子阿斯图里亚斯王子约翰（John, prince of Asturias）的出生，进一步巩固了她的统治地位。
对许多人来说，男继承人的出现进一步确认了她作为统治者的合法性。
与此同时，卡斯蒂利亚和葡萄牙的舰队在大西洋上争夺霸权及几内亚（Guinea）的财富（主要是金子和奴隶），决定性的几内亚海战（battle of Guinea）也在此期间爆发。
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